Wpływ utraty wagi na aktywność i ekspresję lipazy lipoproteinowej tkanki tłuszczowej u bardzo otyłych ludzi ad

Część wyciętej tkanki umieszczono w lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i natychmiast poddano obróbce w celu oznaczenia aktywności lipazy lipoproteinowej i białka immunoreaktywnego. Drugą część tkanki tłuszczowej natychmiast zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -70 ° C do późniejszej izolacji RNA. Pacjenci podjęli następnie program redukcji wagi składający się z diety o bardzo niskiej kaloryczności (Health Management Resources, Freeport, NY), wraz z modyfikacją zachowania i edukacją żywieniową. Po tym, jak każdy osobnik stracił na wadze, wznowił normalną dietę i utrzymywał utratę wagi przez co najmniej trzy miesiące, przeprowadzono drugą biopsję tłuszczu. Następnie pacjenci stosowali standardową dietę izokaloryczną przez jeden dzień, a po 12-godzinnym poście poddano biopsji tkanki tłuszczowej po stronie brzucha naprzeciwko pierwszego miejsca biopsji. Tkankę obrabiano w taki sam sposób jak opisano powyżej. Protokół ten został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję recenzentów Cedars-Sinai Medical Centre. Aktywność katalityczna lipazy lipoproteinowej
Aktywność lipazy lipoproteinowej rozdzielono na dwie frakcje, jak opisano poprzednio21: aktywność uwalniana przez heparynę i aktywność wyekstrahowana z tkanki po wywołaniu heparyną. W celu przygotowania frakcji uwalniającej heparynę, tkankę tłuszczową rozdrobniono i inkubowano z 13 .g heparyny na mililitr (Fisher, Pittsburgh) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez 45 minut w 37 ° C. Próbkę pożywki inkubacyjnej badano następnie pod względem aktywności lipazy lipoproteinowej, jak opisano poniżej. Następnie tkankę potraktowaną heparyną przemyto jednokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, a frakcję do ekstrakcji przygotowano przez homogenizację tkanki w buforze zawierającym deoksycholan i heparynę, jak opisano poprzednio 19, 22 Próbkę odwirowano i zebrano warstwę wodną. i testowano w trzech powtórzeniach dla aktywności lipazy lipoproteinowej.
Test aktywności lipazy lipoproteinowej przeprowadzono jak opisano poprzednio. Użyliśmy substratu zawierającego [14C] trioleinę zemulgowaną lecytyną i normalną ludzką surowicą jako źródłem apolipoproteiny C-II. Próbki inkubowano z roztworem substratu przez 45 minut w 37 ° C i znakowane 14C wolne kwasy tłuszczowe rozdzielano zgodnie ze sposobem Beifrage i Vaughn.24. Lipazę lipoproteinową wyrażano jako nano-równoważniki wolnego kwasu tłuszczowego uwalnianego na minutę na minutę. 106 komórek, a liczbę komórek określono zgodnie z metodą Di Girolamo i wsp.25
Lipazy lipoproteinowe Białko immunoreaktywne
Aby określić masę białka immunoreaktywnego lipazy lipoproteinowej, przygotowano próbki tkanek, jak opisano powyżej, do oznaczenia aktywności lipazy lipoproteinowej, z wyjątkiem dodawania inhibitorów proteazy.19 Test immunoenzymatyczny (ELISA) do pomiaru masy lipazy lipoproteinowej białko immunoreaktywne zostało opisane wcześniej; dane wyrażono jako nanogramy immunoreaktywnej lipazy lipoproteinowej na 106 komórek.19 W skrócie, płytkę do mikromiareczkowania powleczono oczyszczonym przez powinowactwo przeciwciałem lipazy z kurczaka i lipoproteiny, a próbki i standardy lipazy wołowej lipazy zastosowano w buforze zawierającym M sodu. chlorek, 0,1% Triton X-100, 0,1% albuminy, inhibitory proteazy i 25 mM TRIS kwas chlorowodorowy (pH 7,4)
[patrz też: tamponada nosa, wałeczki ziarniste w moczu, chlamydia pneumoniae leczenie ]