Wpływ utraty wagi na aktywność i ekspresję lipazy lipoproteinowej tkanki tłuszczowej u bardzo otyłych ludzi cd

Następnie dodano biotynylowane przeciwciało przeciwko lipazie lipidowej, a następnie peroksydazę chrzanową streptawidynę (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Md.). Reakcję barwną oznaczono ilościowo na czytniku płytek ELISA przy 490 nm. Próbki uzyskane przed i po utracie wagi osobników badano w dwóch powtórzeniach na tej samej płytce ELISA w celu zminimalizowania zmienności między testami. Western Blotting
Jak opisano wcześniej, 21 próbek tkanki tłuszczowej homogenizowano z opisanym wyżej buforem deoksycholan-heparyna dla frakcji ekstrahowalnej, z tym wyjątkiem, że obecne były inhibitory proteazy (ale nie albumina). Po przeprowadzeniu elektroforezy w warunkach denaturujących na 12% żelu dodecylosiarczano-poliakryloamidowym, rozdzielone białka przeniesiono elektroforetycznie na membranę nitrocelulozową, którą inkubowano z antyserumą lipazy anty lipoproteinowej, a następnie antyserię króliczą (Sigma, St. Louis). ) i [125I] białka A (Amersham, Arlington Heights, IL.). Prążki lipazy lipoproteinowej następnie wizualizowano przez autoradiografię.
Ekstrakcja RNA i analiza Northern Blot i Slot-Blot
Izolację RNA z tkanki tłuszczowej przeprowadzono metodą tiocyjanianowo-fenolowo-chloroformową guanidyniową Chomczyńskiego i Sacchi ego, a RNA spektrofotometrycznie określono ilościowo. Jak opisano wcześniej, wyekstrahowane próbki RNA poddano elektroforezie na 2,2 M żelu agarozowym formaldehydu-1 i przeniesiono na membranę nylonową (Hybond-N; Amersham) do analizy Northern blot lub bezpośrednio na membranę nylonową ze szczeliną -blokowe urządzenie rozgałęźne (Schleicher i Schuell, Keene, NH) do analizy szczelinowej. Analizy Northern i slot blot obciążono równymi ilościami całkowitego RNA. Załadowanie żeli według ilości RNA dawało takie same wyniki jak ładowanie ich zgodnie z liczbą komórek adipocytów lub zawartością DNA27 oryginalnej próbki tkanki tłuszczowej. Błony błonowe hybrydyzowano z znakowanymi 32P sondami DNA (cDNA )28 kodującymi ludzką lipazę lipoproteinową20 i gamma-aktynę29. Po hybrydyzacji i przepłukaniu membran, jak opisano w innym miejscu, 21 obrazy oznaczono ilościowo na podstawie autoradiografii i densytometrii.
Analiza statystyczna
Rycina 3. Ryc. 3. Związek między wzrostem lipazy lipoproteinowej a początkowym stopniem otyłości. Wzrost aktywności lipazy lipoproteinowej uwalniającej heparynę (panel A) i masy immunoreaktywnego białka (panel B) z powodu utraty masy ciała u każdego osobnika wykreślono na rzędnej, a wyjściowy wskaźnik masy ciała osobnika wykreślono na odciętej. FFA oznacza wolny kwas tłuszczowy.
Dane wyrażono jako średnie . SEM, a różnice między grupami analizowano za pomocą sparowanego dwustronnego testu t-Studenta. Dane na Figurze 3 analizowano za pomocą analizy regresji liniowej.
Wyniki
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka uczestników badania. Charakterystykę otyłych osób rekrutowanych do tego badania przedstawiono w tabeli 1. Średni początkowy wskaźnik masy ciała (waga w kilogramach podzielona przez kwadrat wysokości w metrach) wynosiła 43,0, co wskazuje, że ci pacjenci byli dość otyli
[więcej w: chlamydia pneumoniae leczenie, osteoprotegeryna, tamponada nosa ]